Avaliação do efeito de Bacillus alcalophilus na inibição do crescimento de Colletotrichum spp.
Autores
Prof. Dr. Walmes Zeviani
Débora Petermann
1 Sobre o experimento
Introdução
Este estudo teve como objetivo avaliar o impacto de diferentes tempos de cultivo (24 ou 48 horas) da bactéria Bacillus alcalophilus, bem como a separação entre a biomassa e o sobrenadante dessa bactéria, no processo de inibição do crescimento micelial de duas espécies de fungos: Colletotrichum nymphaeae e Colletotrichum chrysophilum, ambas sensíveis e com sensibilidade reduzida a fungicidas. O diâmetro da colônia foi a variável analisada, expressa em milímetros. Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Epidemiologia para o Manejo Integrado de Doenças de Plantas (LEMID) sob a supervisão da professora doutora Louise Larissa May De Mio.
Materiais e Métodos
Os experimentos foram conduzidos em um delineamento inteiramente casualizado (DIC) com 5 tratamentos e 4 isolados, totalizando 20 combinações experimentais, cada uma com 5 repetições. Os tratamentos utilizados foram:
(24SBa) Sobrenadante da bactéria B. alcalophilus cultivada no laboratório por 24 horas;
(24BBa) Biomassa da bactéria B. alcalophilus cultivada no laboratório por 24 horas;
(48SBa) Sobrenadante da bactéria B. alcalophilus cultivada no laboratório por 48 horas;
(48BBa) Biomassa da bactéria B. alcalophilus cultivada no laboratório por 48 horas;
(Controle) Testemunha composta por água esterilizada.
Os isolados utilizados foram:
MdCn-CA32M: C. nymphaeae sensível a fungicidas;
MdCn-179: C. nymphaeae sensibilidade reduzida a fungicidas;
MdCc-Col33: C. chrysophillum sensível a fungicidas;
MdCc-134: C. chrysophillum sensibilidade reduzida a fungicidas.
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada em duas etapas. Primeiro, os dados foram analisados separadamente para os Experimentos 1 e 2. Em seguida, uma análise fatorial foi conduzida, considerando dois fatores principais: tratamentos (os 5 listados acima) e isolados (comparando apenas entre dois isolados de C. nymphaeae e dois isolados de C. chrysophillum). O objetivo foi avaliar como esses fatores afetaram o diâmetro das colônias dos fungos.
O modelo estatístico para os dados obtidos a partir de um experimento em delineamento inteiramente casualizado com 5 repetições, que avaliou 2 fatores em forma completamente cruzada está especificado a seguir.
A variável resposta, que é o diâmetro da colônia, pode ser representada por \(Y_{ijk}\), onde:
\(i\) representa o nível do primeiro fator (isolado de Colletotrichum) com \(i = 1, \ldots, 4\).
\(j\) representa o nível do segundo fator (aplicação de Bacillus alcalophilus) com \(j = 1, \ldots, 5\).
\(k\) representa o número da repetição com \(k = 1, \ldots, 5\).
O modelo estatístico para esses dados é \[
Y_{ijk} = \mu + \tau_i + \beta_j + (\tau\beta)_{ij} + \epsilon_{ijk}
\] em que
\(\mu\) é uma constante comum a todas as observações.
\(\tau_i\) é o efeito do \(i\)-ésimo nível do primeiro fator (isolado de Colletotrichum).
\(\beta_j\) é o efeito do \(j\)-ésimo nível do segundo fator (aplicação de Bacillus alcalophilus).
\((\tau\beta)_{ij}\) é a interação entre o \(i\)-ésimo nível do primeiro fator e o \(j\)-ésimo nível do segundo fator.
\(\epsilon_{ijk}\) é o erro aleatório associado à observação \(Y_{ijk}\).
Este modelo apresenta os seguintes pressupostos:
Normalidade dos erros (\(\epsilon_{ijk}\)): Assume-se que os erros aleatórios seguem uma distribuição normal com média zero e variância constante para cada combinação de níveis dos fatores. Isso pode ser expresso como \(\epsilon_{ijk} \sim N(0, \sigma^2)\), onde \(\sigma^2\) é a variância dos erros.
Independência dos erros (\(\epsilon_{ijk}\)): Assume-se que os erros aleatórios são independentes entre as diferentes combinações de níveis dos fatores e repetições.
Homogeneidade de variâncias: Pressupõe-se que a variância dos erros, \(\sigma^2\), seja constante para todas as combinações de níveis dos fatores e repetições.
Estes pressupostos são fundamentais para a interpretação e inferência a partir do modelo estatístico e serão verificados por meio de análise gráfica dos resíduos de resíduos. Havendo indicações de violação dos pressupostos pela análise integrada dos gráficos, medidas corretivas serão aplicadas como transformação da variável resposta (via Box-Cox) ou eliminação de valores discrepantes.
Uma vez que os pressupostos forem atendidos, o efeito da interação será avaliado pela estatística F do quadro de ANOVA, seguindo para os efeitos principais dos dois fatores. Quando alguma das hipóteses do quadro de ANOVA for rejeitada, será feito estudo detalhado empregando comparação múltipla de médias pelo teste de Tukey. Para todos os procedimentos inferenciais, o nível de significância é de 0.05.
2 Análise dos dados
Código
#-----------------------------------------------------------------------# Pacotes.library(car)library(emmeans)library(tidyverse)#-----------------------------------------------------------------------# Importação e preparo.# Importação.# readxl::excel_sheets("analises_artigo_mestrado.xlsx")tb <- readxl::read_excel("analises_artigo_mestrado.xlsx",sheet ="Tcc-micel ")# Nomes em caixa baixa.tb <- tb |>rename_with(tolower) |>rename("diameter"="colony diameter (mm)")# str(tb)# Alguns erros de digitação da `specie` precisam ser corrigidos.tb_fix <- tb |>count(isolated, species, phenotype, sort =TRUE) |>slice_head(n =4)# Corrigindo valores de `specie` e `phenotype` para `isolated`.tb <- tb |>select(-species, -phenotype) |>left_join(tb_fix[, 1:3], by ="isolated")# Variáveis `specie` e `phenotype` são características do isolado.tb |>count(isolated, species, phenotype, sort =TRUE)
# A tibble: 4 × 4
isolated species phenotype n
<chr> <chr> <chr> <int>
1 MdCc-Col134 C. chrysophillum Reduced sensitivity 50
2 MdCc-Col33 C. chrysophillum Sensitive 50
3 MdCn-179 C. nymphaeae Reduced sensitivity 50
4 MdCn-CA32M C. nymphaeae Sensitive 50
Código
# Variável `experiment` é a repetição do experimento.tb |>xtabs(formula =~treatment + experiment)
# ggplot(data = tb,# mapping = aes(x = time, y = diameter,# color = isolated)) +# facet_grid(facets = font ~ experiment) +# geom_point() +# stat_summary(fun = "mean", geom = "line")# NOTE: Sem problemas aparentes em relação a observações extremas.#-----------------------------------------------------------------------# A pesquisadora deseja que os experimentos sejam analisados# separadamente. Além disso, em cada experimento é para comparar apenas# isolados que sejam de mesma espécie.
2.1 Experimento 1
Código
#-----------------------------------------------------------------------# Análise do experimento 1. --------------------------------------------# Filtra para um dos experimentos.tbi <- tb |>filter(experiment =="1")# Ajuste do modelo aos dados.m0 <-lm(diameter ~ treatment * isolated, data = tbi)# Exame gráfico integrado dos pressupostos.par(mfrow =c(2, 2))plot(m0)
Código
layout(1)# car::residualPlots(m0)# car::qqPlot(m0)# Quadro de análise de variância.anova(m0)
# Para armazenar as comparações de médias.tb_means <-list(isolated =NULL, treatment =NULL)# Aplica o teste de comparação de médias separado por espécie.tb_means$isolated[["C. nymphaeae"]] <-emmeans(m1,specs =~isolated,at =list(isolated = tb_iso[["C. nymphaeae"]])) |> multcomp::cld(Letters = letters, reversed =TRUE)tb_means$isolated[["C. chrysophillum"]] <-emmeans(m1,specs =~isolated,at =list(isolated = tb_iso[["C. chrysophillum"]])) |> multcomp::cld(Letters = letters, reversed =TRUE)tb_means$isolated
$`C. nymphaeae`
isolated emmean SE df lower.CL upper.CL .group
MdCn-CA32M 29.0 0.351 92 28.3 29.7 a
MdCn-179 23.8 0.351 92 23.1 24.5 b
Results are averaged over the levels of: treatment
Confidence level used: 0.95
significance level used: alpha = 0.05
NOTE: If two or more means share the same grouping symbol,
then we cannot show them to be different.
But we also did not show them to be the same.
$`C. chrysophillum`
isolated emmean SE df lower.CL upper.CL .group
MdCc-Col134 29.0 0.351 92 28.3 29.7 a
MdCc-Col33 28.7 0.351 92 28.0 29.4 a
Results are averaged over the levels of: treatment
Confidence level used: 0.95
significance level used: alpha = 0.05
NOTE: If two or more means share the same grouping symbol,
then we cannot show them to be different.
But we also did not show them to be the same.
Código
# Junta os resultados em um única tabela para fazer os gráficos.tb_means$isolated <- tb_means$isolated |>map(as.data.frame) |>bind_rows(.id ="species") |>mutate(.group =trimws(.group))tb_means$isolated
species isolated emmean SE df lower.CL upper.CL .group
1 C. nymphaeae MdCn-CA32M 28.9700 0.3506509 92 28.27358 29.66642 a
2 C. nymphaeae MdCn-179 23.8308 0.3506509 92 23.13438 24.52722 b
3 C. chrysophillum MdCc-Col134 29.0384 0.3506509 92 28.34198 29.73482 a
4 C. chrysophillum MdCc-Col33 28.6904 0.3506509 92 27.99398 29.38682 a
#-----------------------------------------------------------------------# Análise do experimento 2. --------------------------------------------# Filtra para um dos experimentos.tbi <- tb |>filter(experiment =="2")# Ajuste do modelo aos dados.m0 <-lm(diameter ~ treatment * isolated, data = tbi)# Exame gráfico integrado dos pressupostos.par(mfrow =c(2, 2))plot(m0)
Código
layout(1)# car::residualPlots(m0)# car::qqPlot(m0)# Quadro de análise de variância.anova(m0)
# Para armazenar as comparações de médias.tb_means <-list(isolated =NULL, treatment =NULL)# Aplica o teste de comparação de médias separado por espécie.tb_means$isolated[["C. nymphaeae"]] <-emmeans(m1,specs =~isolated,at =list(isolated = tb_iso[["C. nymphaeae"]])) |> multcomp::cld(Letters = letters, reversed =TRUE)tb_means$isolated[["C. chrysophillum"]] <-emmeans(m1,specs =~isolated,at =list(isolated = tb_iso[["C. chrysophillum"]])) |> multcomp::cld(Letters = letters, reversed =TRUE)tb_means$isolated
$`C. nymphaeae`
isolated emmean SE df lower.CL upper.CL .group
MdCn-CA32M 33.0 0.392 92 32.2 33.8 a
MdCn-179 28.1 0.392 92 27.3 28.9 b
Results are averaged over the levels of: treatment
Confidence level used: 0.95
significance level used: alpha = 0.05
NOTE: If two or more means share the same grouping symbol,
then we cannot show them to be different.
But we also did not show them to be the same.
$`C. chrysophillum`
isolated emmean SE df lower.CL upper.CL .group
MdCc-Col134 32.8 0.392 92 32 33.5 a
MdCc-Col33 31.8 0.392 92 31 32.6 a
Results are averaged over the levels of: treatment
Confidence level used: 0.95
significance level used: alpha = 0.05
NOTE: If two or more means share the same grouping symbol,
then we cannot show them to be different.
But we also did not show them to be the same.
Código
# Junta os resultados em um única tabela para fazer os gráficos.tb_means$isolated <- tb_means$isolated |>map(as.data.frame) |>bind_rows(.id ="species") |>mutate(.group =trimws(.group))tb_means$isolated
species isolated emmean SE df lower.CL upper.CL .group
1 C. nymphaeae MdCn-CA32M 32.9880 0.3923866 92 32.20869 33.76731 a
2 C. nymphaeae MdCn-179 28.0968 0.3923866 92 27.31749 28.87611 b
3 C. chrysophillum MdCc-Col134 32.7560 0.3923866 92 31.97669 33.53531 a
4 C. chrysophillum MdCc-Col33 31.8004 0.3923866 92 31.02109 32.57971 a
