Avaliação do efeito de produtos biológicos e químicos após a germinação de Colletotrichum spp.
Autores
Prof. Dr. Walmes Zeviani
Débora Petermann
1 Sobre o experimento
Introdução
Este estudo tem como objetivo avaliar o efeito de diferentes produtos biológicos e um produto químico após a germinação dos conídios de Colletotrichum nymphaeae e C. chrysophilum, incluindo cepas sensíveis e com sensibilidade reduzida a fungicidas. A variável de interesse é o diâmetro das colônias, medido em milímetros.
Materiais e Métodos
Os experimentos 1 e 2 foram realizados no Laboratório de Epidemiologia para o Manejo Integrado de Doenças de Plantas (LEMID) sob a supervisão da aluna de mestrado Débora Petermann, orientada pela professora doutora Louise Larissa May De Mio.
Experimento 2:
Data de montagem: 10 de junho de 2022.
Data de avaliação: 15 de junho de 2022.
Estrutura do experimento: 8 tratamentos, 4 isolados e 3 repetições (placas), com dois valores por placa devido à adição de duas gotas do produto + esporo.
Foram utilizados os seguintes tratamentos:
Bacillus amyloliquefaciens na dosagem de 0,5g/L (Bam 0,5g/L) - produto biológico.
Bacillus amyloliquefaciens na dosagem de 1,0g/L (Bam 1,0g/L) - produto biológico.
Bacillus amyloliquefaciens na dosagem de 2,0g/L (Bam 2,0g/L) - produto biológico.
Bacillus subtilis (Bs) - produto biológico.
Sobrenadante de Bacillus alcalophilus (SBa) - produto biológico.
Biomassa de Bacillus alcalophilus (BBa) - produto biológico.
CabrioTop - produto químico.
Testemunha composta por água esterilizada (Controle).
Os isolados utilizados foram:
MdCn-142: C. nymphaeae sensível a fungicida.
MdCn-181: C. nymphaeae sensibilidade reduzida a fungicida.
MdCc-110: C. chrysophillum sensível a fungicida.
MdCc-55PR: C. chrysophillum sensibilidade reduzida a fungicida.
Metodologia
Neste experimento, após a germinação dos conídios e antes de paralisar a germinação com lactofenol, foram retiradas gotas contendo o produto e os esporos dos fungos após 12 horas de contato. Essas gotas foram então colocadas em placas de vidro contendo um meio de cultura rico em nutrientes. Essa metodologia foi aplicada apenas no experimento 2. A decisão de adotar essa abordagem foi tomada devido às altas porcentagens de germinação observadas no experimento 1, o que levantou preocupações sobre a eficácia dos produtos. A literatura indicou que, mesmo com o contato com alguns produtos, os esporos podem germinar, mas a germinação pode não ser viável. Portanto, ao transferir os esporos para o meio de cultura, pôde-se observar que, embora a germinação tenha ocorrido em muitos tratamentos, o crescimento subsequente das colônias foi inibido, indicando a inviabilidade da germinação.
Análise Estatística
A análise estatística será conduzida por meio de uma análise fatorial, em que um dos fatores será composto pelos tratamentos (8 tratamentos) e o segundo fator pelos isolados (4 isolados). A ênfase será na comparação entre os dois isolados de C. nymphaeae (sensível e sensibilidade reduzida) e os dois isolados de C. chrysophilum (sensível e sensibilidade reduzida). É importante ressaltar que os experimentos 1 e 2 serão analisados separadamente.
O crescimento apresentou vários zeros indicando que não houve germinação. Para contornar o muito provável afastamento dos pressupostos decorrente do excesso de valores iguais a zero, optou-se por cortar os valores em classe e análisar como resposta de sobreviência, ainda mantendo a suposição de distribuição normal. Dessa maneira, valores iguais a zero ou muito próximo de, que caírem na primeira classe, serão considerados censuras intervalares. Valores positivos que estiverem além da primeira classe, não serão considerados censurados. Para amplitude de classe considerou-se 2.5 mm.
Ao final, pode-se apresentar as médias amostrais de diâmetro ao lado das estimativas obtidas com o modelo de sobreviência.
2 Análise de dados
Código
#-----------------------------------------------------------------------# Pacotes.library(car)library(emmeans)library(survival)library(tidyverse)#-----------------------------------------------------------------------# Importação e preparo.# Importação.tb <- readxl::read_excel("analises_artigo_mestrado.xlsx",sheet ="5 plaqueamento")# Nomes em caixa baixa.tb <- tb |>rename_with(tolower) |>rename("diameter"="colony diameter (mm)")str(tb)
# Alguns erros de digitação da `specie` precisam ser corrigidos.tb_fix <- tb |>count(isolated, species, phenotype, sort =TRUE) |>slice_head(n =4)# Corrigindo valores de `specie` e `phenotype` para `isolated`.tb <- tb |>select(-species, -phenotype) |>left_join(tb_fix[, 1:3], by ="isolated")# Variáveis `specie` e `phenotype` são características do isolado.tb |>count(isolated, species, phenotype, sort =TRUE)
# A tibble: 4 × 4
isolated species phenotype n
<chr> <chr> <chr> <int>
1 MdCc-110 C. chrysophillum Sensitive 48
2 MdCc-55PR C. chrysophillum Reduced sensitivity 48
3 MdCn-142 C. nymphaeae Sensitive 48
4 MdCn-181 C. nymphaeae Reduced sensitivity 48
Código
# Variável `experiment` é a repetição do experimento.tb |>xtabs(formula =~treatment + experiment)
# Passa para fator.tb <- tb |>mutate_at(c("treatment", "isolated", "experiment"), factor)# Coloca em um ordem mais lógica.# levels(tb$treatment) |> dput()tb$treatment <-fct_relevel(tb$treatment,"Control","Bam 0,5g/L", "Bam 1,0g/L", "Bam 2,0g/L","SBa", "BBa", "Bs","CabrioTop®")#-----------------------------------------------------------------------# Visualização.ggplot(data = tb,mapping =aes(x = treatment, y = diameter,color = isolated, group = isolated)) +geom_point() +stat_summary(fun ="mean", geom ="line")
Código
# ATTENTION: Presença de zeros que corresponde a esporos que não# germinaram.# Qual a frequência de zeros?tb |>mutate(zero =ifelse(diameter ==0, "zero", "positive")) |>count(treatment, experiment, isolated, zero) |>pivot_wider(names_from = zero,values_from = n,values_fill =0) |>arrange(zero) |>print(n =Inf)
# Algumas combinações experimentais tem todas as repetições com zero de# crescimento micelial. Isso corresponde a problemas com pressupostos.# Seria interessante cortar em classes de crescimento micelial e# analisar como uma resposta de sobreviência.# Faça um histograma da variável `diameter` por `experiment`.ggplot(data = tb,aes(x = diameter)) +geom_histogram(binwidth =2.5, color ="black") +geom_rug()
Código
#-----------------------------------------------------------------------# Corta a resposta em classe.# Cortar a resposta em classes.binwidth <-2.5breaks <-seq(from =0,to =max(tb$diameter) + binwidth,by = binwidth)tb$diameter_class <-cut(tb$diameter,breaks = breaks,include.lowest =TRUE)# Separar valores para criar os limites do intervalo.tb <- tb |>mutate(newvalue =as.character(diameter_class),newvalue =trimws(str_replace_all(newvalue,pattern ="[\\[(\\]]",replacement =" "))) |>separate(newvalue,into =c("left", "right"),sep =",",convert =TRUE)# IMPORTANT: Aqui foi feito censura intervalar para a primeira classe# que é o intervalo que contém o 0. Valores positivos que cairam nas# demais classes são declarados com eventos sem censura.# `i` indica se é a classe que contém o 0 ou não.tb <- tb |>mutate(i = diameter_class ==levels(diameter_class)[1],status =ifelse(i, yes =3, no =1),right =ifelse(i, yes = right, no = diameter),left =ifelse(i, yes = left, no = diameter))
