Efeito de produtos biológicos e químicos na inibição do crescimento micelial de Colletotrichum spp.

Autores

Prof. Dr. Walmes Zeviani

Débora Petermann

1 Sobre o experimento

Introdução

Neste estudo, foi investigado o impacto de diferentes produtos biológicos e um produto químico na inibição do crescimento micelial de cinco diferentes espécies de Colletotrichum. A variável resposta analisada foi o diâmetro das colônias, expresso em milímetros.

Materiais e Métodos

Os experimentos 1 e 2 foram realizados no Laboratório de Epidemiologia para o Manejo Integrado de Doenças de Plantas (LEMID) sob a supervisão da aluna de mestrado Débora Petermann e da professora doutora Louise Larissa May De Mio.

  • Experimento 1:
    • Data de montagem: 17 de janeiro de 2022
    • Data de avaliação: 24 de janeiro de 2022
    • Estrutura do experimento: 6 tratamentos, 5 isolados e 3 repetições
  • Experimento 2:
    • Data de montagem: 24 de janeiro de 2022
    • Data de avaliação: 31 de janeiro de 2022
    • Estrutura do experimento: 6 tratamentos, 5 isolados e 4 repetições

Os tratamentos utilizados foram:

  1. Biomassa de Bacillus alcalophilus (BBa) - produto biológico.
  2. Sobrenadante de Bacillus alcalophilus (SBa) - produto biológico.
  3. Bacillus subtilis (Bs) - produto biológico.
  4. Bacillus amyloliquefaciens na dose de 1,0g/L (Bam 1,0g/L) - produto biológico.
  5. Delan - produto químico.
  6. Testemunha composta por água esterilizada (Controle).

Os isolados de Colletotrichum utilizados foram:

  • MdCn-142: C. nymphaeae.
  • MdCc-110: C. chrysophillum.
  • MdCs-3R4E: C. siamensis.
  • MdCm-21: C. melonis.
  • MdCl-180: C. limetticolum.

Análise Estatística

O objetivo da análise estatística é realizar uma análise fatorial, onde um dos fatores é composto pelos tratamentos (os 6) e o segundo fator pelos isolados (os 5). Neste caso, todos os isolados podem ser analisados juntos, sem separação. Além disso, os experimentos 1 e 2 serão analisados separadamente.

2 Análise dos dados

Código 
#-----------------------------------------------------------------------
# Pacotes.

library(car)
library(emmeans)
library(tidyverse)

#-----------------------------------------------------------------------
# Importação e preparo.

# Importação.
tb <- readxl::read_excel(
    "analises_artigo_mestrado.xlsx",
    sheet = "2 spp")

# Nomes em caixa baixa.
tb <- tb |>
    rename_with(tolower) |>
    rename("diameter" = "colony diameter (mm)",
           "treatment" = "tratament")
str(tb)
tibble [210 × 6] (S3: tbl_df/tbl/data.frame)
 $ experiment: num [1:210] 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ...
 $ treatment : chr [1:210] "BBa" "BBa" "BBa" "SBa" ...
 $ isolated  : chr [1:210] "MdCn-142" "MdCn-142" "MdCn-142" "MdCn-142" ...
 $ species   : chr [1:210] "C. nymphaeae" "C. nymphaeae" "C. nymphaeae" "C. nymphaeae" ...
 $ repetition: num [1:210] 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 ...
 $ diameter  : num [1:210] 25.8 27 24.1 25.8 22.1 ...
Código 
# Variáveis `specie` e `phenotype` são características do isolado.
tb |>
    count(isolated, species, sort = TRUE)
# A tibble: 5 × 3
  isolated  species              n
  <chr>     <chr>            <int>
1 MdCc-110  C. chrysophillum    42
2 MdCl-180  C. limetticolum     42
3 MdCm-21   C. melonis          42
4 MdCn-142  C. nymphaeae        42
5 MdCs-3R4E C. siamensis        42
Código 
# Variável `experiment` é a repetição do experimento.
tb |>
    xtabs(formula = ~treatment + experiment)
            experiment
treatment     1  2
  Bam 1,0g/L 15 21
  BBa        15 21
  Bs         15 18
  Control    15 18
  Delan®     15 21
  SBa        15 21
Código 
# A frequência de cada combinação experimental.
tb |>
    xtabs(formula = ~experiment + isolated + treatment) |>
    ftable()
                     treatment Bam 1,0g/L BBa Bs Control Delan® SBa
experiment isolated                                                
1          MdCc-110                     3   3  3       3      3   3
           MdCl-180                     3   3  3       3      3   3
           MdCm-21                      3   3  3       3      3   3
           MdCn-142                     3   3  3       3      3   3
           MdCs-3R4E                    3   3  3       3      3   3
2          MdCc-110                     6   3  3       3      6   3
           MdCl-180                     3   3  6       6      3   3
           MdCm-21                      6   3  3       3      6   3
           MdCn-142                     3   6  3       3      3   6
           MdCs-3R4E                    3   6  3       3      3   6
Código 
# Passa para fator.
tb <- tb |>
    mutate_at(c("treatment", "isolated", "experiment"), factor)

# Coloca em um ordem mais lógica.
# levels(tb$treatment) |> dput()
tb$treatment <- fct_relevel(tb$treatment,
                            "Control",
                            "BBa",
                            "SBa",
                            "Bs",
                            "Bam 1,0g/L",
                            "Delan®")

#-----------------------------------------------------------------------
# Visualização.

ggplot(data = tb,
       mapping = aes(x = treatment, y = diameter,
                     color = isolated, group = isolated)) +
    facet_grid(facets = ~experiment) +
    geom_point() +
    stat_summary(fun = "mean", geom = "line")

Código 
# NOTE: Sem problemas aparentes em relação a observações extremas.

2.1 Experimento 1

Código 
#-----------------------------------------------------------------------
# Análise do experimento 1. --------------------------------------------

# Filtra para um dos experimentos.
tbi <- tb |>
    filter(experiment == "1")

# Ajuste do modelo aos dados.
m0 <- lm(diameter ~ treatment * isolated, data = tbi)

# Exame gráfico integrado dos pressupostos.
par(mfrow = c(2, 2))
plot(m0)

Código 
layout(1)

# car::residualPlots(m0)
# car::qqPlot(m0)

# Quadro de análise de variância.
anova(m0)
Analysis of Variance Table

Response: diameter
                   Df Sum Sq Mean Sq  F value    Pr(>F)    
treatment           5 9933.2 1986.63 449.6575 < 2.2e-16 ***
isolated            4  505.8  126.44  28.6188 2.559e-13 ***
treatment:isolated 20  341.2   17.06   3.8611 2.554e-05 ***
Residuals          60  265.1    4.42                       
---
Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
Código 
# Para armazenar as comparações de médias.
tb_means <- list(isolated = NULL, treatment = NULL)

# Aplica o teste de comparação de médias separado por espécie.
tb_means$isolated <-
    emmeans(m0,
            specs = ~isolated | treatment) |>
    multcomp::cld(Letters = letters, reversed = TRUE) |>
    as.data.frame() |>
    mutate(.group = trimws(.group))
tb_means$isolated
    isolated  treatment   emmean       SE df lower.CL upper.CL .group
3  MdCs-3R4E    Control 46.00000 1.213549 60 43.57254 48.42746      a
4   MdCc-110    Control 43.78500 1.213549 60 41.35754 46.21246      a
2   MdCl-180    Control 43.04167 1.213549 60 40.61421 45.46913      a
1   MdCn-142    Control 41.65333 1.213549 60 39.22587 44.08079      a
5    MdCm-21    Control 34.06833 1.213549 60 31.64087 36.49579      b
8  MdCs-3R4E        BBa 25.78500 1.213549 60 23.35754 28.21246      a
7   MdCn-142        BBa 25.62667 1.213549 60 23.19921 28.05413      a
6   MdCc-110        BBa 24.62667 1.213549 60 22.19921 27.05413     ab
9   MdCl-180        BBa 23.84000 1.213549 60 21.41254 26.26746     ab
10   MdCm-21        BBa 20.19833 1.213549 60 17.77087 22.62579      b
14 MdCs-3R4E        SBa 31.47000 1.213549 60 29.04254 33.89746      a
12   MdCm-21        SBa 29.98000 1.213549 60 27.55254 32.40746     ab
11  MdCc-110        SBa 26.86000 1.213549 60 24.43254 29.28746    abc
13  MdCl-180        SBa 25.52833 1.213549 60 23.10087 27.95579     bc
15  MdCn-142        SBa 24.64833 1.213549 60 22.22087 27.07579      c
18 MdCs-3R4E         Bs 19.71833 1.213549 60 17.29087 22.14579      a
16  MdCn-142         Bs 16.90167 1.213549 60 14.47421 19.32913     ab
17  MdCl-180         Bs 16.15333 1.213549 60 13.72587 18.58079     ab
19  MdCc-110         Bs 15.79000 1.213549 60 13.36254 18.21746     ab
20   MdCm-21         Bs 14.31333 1.213549 60 11.88587 16.74079      b
23 MdCs-3R4E Bam 1,0g/L 19.29500 1.213549 60 16.86754 21.72246      a
21  MdCl-180 Bam 1,0g/L 17.07667 1.213549 60 14.64921 19.50413      a
24  MdCn-142 Bam 1,0g/L 15.88667 1.213549 60 13.45921 18.31413     ab
22  MdCc-110 Bam 1,0g/L 15.56167 1.213549 60 13.13421 17.98913     ab
25   MdCm-21 Bam 1,0g/L 12.08000 1.213549 60  9.65254 14.50746      b
28 MdCs-3R4E     Delan® 46.00000 1.213549 60 43.57254 48.42746      a
29  MdCl-180     Delan® 43.87000 1.213549 60 41.44254 46.29746      a
26  MdCc-110     Delan® 43.26167 1.213549 60 40.83421 45.68913      a
27  MdCn-142     Delan® 41.56000 1.213549 60 39.13254 43.98746      a
30   MdCm-21     Delan® 33.00667 1.213549 60 30.57921 35.43413      b
Código 
ggplot(data = tb_means$isolated,
       mapping = aes(y = isolated, x = emmean)) +
    facet_grid(facets = treatment ~ .) +
    geom_errorbarh(mapping = aes(xmin = lower.CL, xmax = upper.CL),
                   height = 0) +
    geom_point() +
    geom_text(mapping = aes(label = sprintf("%0.1f %s", emmean, .group)),
              vjust = 0, nudge_y = 0.10, size = 2.5) +
    labs(y = "Isolated",
         x = "Colony diameter (mm)")

Código 
# Comparação entre os tratamentos.
tb_means$treatment <-
    emmeans(m0,
            specs = ~treatment | isolated) |>
    multcomp::cld(Letters = letters, reversed = TRUE) |>
    as.data.frame() |>
    mutate(.group = trimws(.group))
tb_means$treatment
    treatment  isolated   emmean       SE df lower.CL upper.CL .group
5     Control  MdCc-110 43.78500 1.213549 60 41.35754 46.21246      a
4      Delan®  MdCc-110 43.26167 1.213549 60 40.83421 45.68913      a
2         SBa  MdCc-110 26.86000 1.213549 60 24.43254 29.28746      b
3         BBa  MdCc-110 24.62667 1.213549 60 22.19921 27.05413      b
6          Bs  MdCc-110 15.79000 1.213549 60 13.36254 18.21746      c
1  Bam 1,0g/L  MdCc-110 15.56167 1.213549 60 13.13421 17.98913      c
10     Delan®  MdCl-180 43.87000 1.213549 60 41.44254 46.29746      a
11    Control  MdCl-180 43.04167 1.213549 60 40.61421 45.46913      a
8         SBa  MdCl-180 25.52833 1.213549 60 23.10087 27.95579      b
9         BBa  MdCl-180 23.84000 1.213549 60 21.41254 26.26746      b
7  Bam 1,0g/L  MdCl-180 17.07667 1.213549 60 14.64921 19.50413      c
12         Bs  MdCl-180 16.15333 1.213549 60 13.72587 18.58079      c
17    Control   MdCm-21 34.06833 1.213549 60 31.64087 36.49579      a
16     Delan®   MdCm-21 33.00667 1.213549 60 30.57921 35.43413      a
14        SBa   MdCm-21 29.98000 1.213549 60 27.55254 32.40746      a
15        BBa   MdCm-21 20.19833 1.213549 60 17.77087 22.62579      b
18         Bs   MdCm-21 14.31333 1.213549 60 11.88587 16.74079      c
13 Bam 1,0g/L   MdCm-21 12.08000 1.213549 60  9.65254 14.50746      c
23    Control  MdCn-142 41.65333 1.213549 60 39.22587 44.08079      a
22     Delan®  MdCn-142 41.56000 1.213549 60 39.13254 43.98746      a
21        BBa  MdCn-142 25.62667 1.213549 60 23.19921 28.05413      b
20        SBa  MdCn-142 24.64833 1.213549 60 22.22087 27.07579      b
24         Bs  MdCn-142 16.90167 1.213549 60 14.47421 19.32913      c
19 Bam 1,0g/L  MdCn-142 15.88667 1.213549 60 13.45921 18.31413      c
29    Control MdCs-3R4E 46.00000 1.213549 60 43.57254 48.42746      a
28     Delan® MdCs-3R4E 46.00000 1.213549 60 43.57254 48.42746      a
26        SBa MdCs-3R4E 31.47000 1.213549 60 29.04254 33.89746      b
27        BBa MdCs-3R4E 25.78500 1.213549 60 23.35754 28.21246      c
30         Bs MdCs-3R4E 19.71833 1.213549 60 17.29087 22.14579      d
25 Bam 1,0g/L MdCs-3R4E 19.29500 1.213549 60 16.86754 21.72246      d
Código 
ggplot(data = tb_means$treatment,
       mapping = aes(y = treatment, x = emmean)) +
    facet_grid(facets = isolated ~ .) +
    geom_errorbarh(mapping = aes(xmin = lower.CL, xmax = upper.CL),
                   height = 0) +
    geom_point() +
    geom_text(mapping = aes(label = sprintf("%0.1f %s", emmean, .group)),
              vjust = 0, nudge_y = 0.10, size = 2.5) +
    labs(y = "Treatment",
         x = "Colony diameter (mm)")

2.2 Experimento 2

Código 
#-----------------------------------------------------------------------
# Análise do experimento 2. --------------------------------------------

# Filtra para um dos experimentos.
tbi <- tb |>
    filter(experiment == "2")

# Ajuste do modelo aos dados.
m0 <- lm(diameter ~ treatment * isolated, data = tbi)

# Exame gráfico integrado dos pressupostos.
par(mfrow = c(2, 2))
plot(m0)

Código 
layout(1)

# car::residualPlots(m0)
# car::qqPlot(m0)

# Quadro de análise de variância.
anova(m0)
Analysis of Variance Table

Response: diameter
                   Df Sum Sq Mean Sq F value    Pr(>F)    
treatment           5  152.8  30.553  0.4735  0.795097    
isolated            4  963.4 240.856  3.7329  0.007406 ** 
treatment:isolated 20 5928.2 296.408  4.5939 2.494e-07 ***
Residuals          90 5807.0  64.523                      
---
Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
Código 
# Para armazenar as comparações de médias.
tb_means <- list(isolated = NULL, treatment = NULL)

# Aplica o teste de comparação de médias separado por espécie.
tb_means$isolated <-
    emmeans(m0,
            specs = ~isolated | treatment) |>
    multcomp::cld(Letters = letters, reversed = TRUE) |>
    as.data.frame() |>
    mutate(.group = trimws(.group))
tb_means$isolated
    isolated  treatment   emmean       SE df  lower.CL upper.CL .group
1   MdCl-180    Control 38.64167 3.279293 90 32.126778 45.15656      a
3  MdCs-3R4E    Control 30.60333 4.637621 90 21.389889 39.81678     ab
4   MdCn-142    Control 25.25333 4.637621 90 16.039889 34.46678     ab
5    MdCm-21    Control 19.22333 4.637621 90 10.009889 28.43678      b
2   MdCc-110    Control 17.66167 4.637621 90  8.448223 26.87511      b
9   MdCc-110        BBa 43.36000 4.637621 90 34.146556 52.57344      a
7  MdCs-3R4E        BBa 32.71500 3.279293 90 26.200111 39.22989     ab
8    MdCm-21        BBa 31.23000 4.637621 90 22.016556 40.44344     ab
10  MdCl-180        BBa 26.65167 4.637621 90 17.438223 35.86511     ab
6   MdCn-142        BBa 25.52583 3.279293 90 19.010945 32.04072      b
12 MdCs-3R4E        SBa 41.09667 3.279293 90 34.581778 47.61156      a
13  MdCn-142        SBa 34.15667 3.279293 90 27.641778 40.67156     ab
11  MdCc-110        SBa 26.06667 4.637621 90 16.853223 35.28011    abc
14   MdCm-21        SBa 22.49333 4.637621 90 13.279889 31.70678     bc
15  MdCl-180        SBa 17.17500 4.637621 90  7.961556 26.38844      c
17 MdCs-3R4E         Bs 46.00000 4.637621 90 36.786556 55.21344      a
18  MdCn-142         Bs 39.14000 4.637621 90 29.926556 48.35344     ab
16  MdCc-110         Bs 26.43333 4.637621 90 17.219889 35.64678      b
19   MdCm-21         Bs 25.95167 4.637621 90 16.738223 35.16511      b
20  MdCl-180         Bs 25.64500 3.279293 90 19.130111 32.15989      b
23  MdCl-180 Bam 1,0g/L 44.69667 4.637621 90 35.483223 53.91011      a
24 MdCs-3R4E Bam 1,0g/L 34.23500 4.637621 90 25.021556 43.44844     ab
21  MdCc-110 Bam 1,0g/L 26.02775 3.279293 90 19.512861 32.54264      b
25  MdCn-142 Bam 1,0g/L 25.61000 4.637621 90 16.396556 34.82344      b
22   MdCm-21 Bam 1,0g/L 23.33583 3.279293 90 16.820945 29.85072      b
29  MdCc-110     Delan® 37.28500 3.279293 90 30.770111 43.79989      a
30   MdCm-21     Delan® 33.43500 3.279293 90 26.920111 39.94989      a
27  MdCl-180     Delan® 25.50500 4.637621 90 16.291556 34.71844     ab
28 MdCs-3R4E     Delan® 23.31000 4.637621 90 14.096556 32.52344     ab
26  MdCn-142     Delan® 16.97000 4.637621 90  7.756556 26.18344      b
Código 
ggplot(data = tb_means$isolated,
       mapping = aes(y = isolated, x = emmean)) +
    facet_grid(facets = treatment ~ .) +
    geom_errorbarh(mapping = aes(xmin = lower.CL, xmax = upper.CL),
                   height = 0) +
    geom_point() +
    geom_text(mapping = aes(label = sprintf("%0.1f %s", emmean, .group)),
              vjust = 0, nudge_y = 0.10, size = 3) +
    labs(y = "Isolated",
         x = "Colony diameter (mm)")

Código 
# Comparação entre os tratamentos.
tb_means$treatment <-
    emmeans(m0,
            specs = ~treatment | isolated) |>
    multcomp::cld(Letters = letters, reversed = TRUE) |>
    as.data.frame() |>
    mutate(.group = trimws(.group))
tb_means$treatment
    treatment  isolated   emmean       SE df  lower.CL upper.CL .group
1         BBa  MdCc-110 43.36000 4.637621 90 34.146556 52.57344      a
5      Delan®  MdCc-110 37.28500 3.279293 90 30.770111 43.79989     ab
3          Bs  MdCc-110 26.43333 4.637621 90 17.219889 35.64678    abc
4         SBa  MdCc-110 26.06667 4.637621 90 16.853223 35.28011    abc
6  Bam 1,0g/L  MdCc-110 26.02775 3.279293 90 19.512861 32.54264     bc
2     Control  MdCc-110 17.66167 4.637621 90  8.448223 26.87511      c
9  Bam 1,0g/L  MdCl-180 44.69667 4.637621 90 35.483223 53.91011      a
12    Control  MdCl-180 38.64167 3.279293 90 32.126778 45.15656     ab
10        BBa  MdCl-180 26.65167 4.637621 90 17.438223 35.86511    abc
8          Bs  MdCl-180 25.64500 3.279293 90 19.130111 32.15989     bc
7      Delan®  MdCl-180 25.50500 4.637621 90 16.291556 34.71844     bc
11        SBa  MdCl-180 17.17500 4.637621 90  7.961556 26.38844      c
13     Delan®   MdCm-21 33.43500 3.279293 90 26.920111 39.94989      a
15        BBa   MdCm-21 31.23000 4.637621 90 22.016556 40.44344      a
17         Bs   MdCm-21 25.95167 4.637621 90 16.738223 35.16511      a
16 Bam 1,0g/L   MdCm-21 23.33583 3.279293 90 16.820945 29.85072      a
14        SBa   MdCm-21 22.49333 4.637621 90 13.279889 31.70678      a
18    Control   MdCm-21 19.22333 4.637621 90 10.009889 28.43678      a
24         Bs  MdCn-142 39.14000 4.637621 90 29.926556 48.35344      a
19        SBa  MdCn-142 34.15667 3.279293 90 27.641778 40.67156      a
20 Bam 1,0g/L  MdCn-142 25.61000 4.637621 90 16.396556 34.82344     ab
23        BBa  MdCn-142 25.52583 3.279293 90 19.010945 32.04072     ab
21    Control  MdCn-142 25.25333 4.637621 90 16.039889 34.46678     ab
22     Delan®  MdCn-142 16.97000 4.637621 90  7.756556 26.18344      b
30         Bs MdCs-3R4E 46.00000 4.637621 90 36.786556 55.21344      a
25        SBa MdCs-3R4E 41.09667 3.279293 90 34.581778 47.61156      a
26 Bam 1,0g/L MdCs-3R4E 34.23500 4.637621 90 25.021556 43.44844     ab
29        BBa MdCs-3R4E 32.71500 3.279293 90 26.200111 39.22989     ab
27    Control MdCs-3R4E 30.60333 4.637621 90 21.389889 39.81678     ab
28     Delan® MdCs-3R4E 23.31000 4.637621 90 14.096556 32.52344      b
Código 
ggplot(data = tb_means$treatment,
       mapping = aes(y = treatment, x = emmean)) +
    facet_grid(facets = isolated ~ .) +
    geom_errorbarh(mapping = aes(xmin = lower.CL, xmax = upper.CL),
                   height = 0) +
    geom_point() +
    geom_text(mapping = aes(label = sprintf("%0.1f %s", emmean, .group)),
              vjust = 0, nudge_y = 0.10, size = 3) +
    labs(y = "Treatment",
         x = "Colony diameter (mm)")

Código 
#-----------------------------------------------------------------------